A lignina é um biopolímero heterogêneo presente nas paredes celulares das plantas e desempenha um papel estrutural importante. Dada a sua abundância (o segundo biopolímero mais abundante na Terra), a lignina é a principal fonte de carbono aromático do planeta, o que destaca a oportunidade de aproveitar esta fonte renovável de produtos químicos valiosos. Os monômeros de lignina podem ser facilmente convertidos em compostos de alto valor - variando de alternativas a produtos químicos à base de petróleo até moléculas farmacêuticas - em muitos ambientes industriais. Porém, atualmente a grande quantidade de lignina gerada na agricultura e na indústria é simplesmente desperdiçada, devido à falta de estratégias para sua valorização. Assim, desenvolver abordagens para funcionalização química de monômeros de lignina é de extrema relevância para a criação de uma linha produtiva mais verde. Estudos recentes elucidaram muitos aspectos de uma enzima oxidativa de Amycolatopsis sp, denominada GcoA, que pertence à classe dos citocromos P450 e é capaz de demetilar os constituintes da lignina para gerar catecol, que pode ser posteriormente funcionalizado para valorizar a lignina. A presente proposta BEPE visa apoiar um estágio de doutorado de 12 meses com o Professor Samuel De Visser na Universidade de Manchester para realizar estudos sobre a atividade da GcoA em componentes de lignina. O Dr. De Visser é um conhecido cientista do Instituto de Biotecnologia de Manchester. O Grupo do Dr. De Visser ganhou destaque na área de citocromos P450, particularmente devido aos seus estudos fortes, relevantes e pioneiros baseados na Teoria Funcional da Densidade com muitas metaloenzimas, entre as quais está o GcoA. Propomos estudar e projetar variantes do GcoA que sejam mais seletivas para outros pequenos componentes e derivados da lignina que ainda não foram testados, como o guaetol. Também estudaremos os perfis de energia livre da reação de GcoA de tipo selvagem e os mutantes propostos usando técnicas clássicas e quânticas clássicas de MD, bem como abordagens quânticas completas baseadas em métodos DFT. Se o tempo permitir, consideramos a engenharia da GcoA para alargar seu sítio de ligação ao substrato, tornando-o capaz de comportar porções maiores de lignina. Para a engenharia do GcoA, inicialmente o local de ligação do substrato será minuciosamente examinado para procurar por resíduos que possam sofrer mutação. Esta etapa fundamental será guiada pela análise de conservação de resíduos e pelos resultados de trabalhos anteriores que redesenharam a GcoA. As mutações propostas no sítio ativo terão como objetivo criar contatos polares que estabilizem o estado de transição de um constituinte de lignina particular - elucidado pelos cálculos quânticos, aumentando assim a seletividade da enzima para um monômero particular. Além disso, técnicas avançadas que examinam o perfil de energia livre de ligação ao substrato serão usadas para comparar perfis de energia livre entre GcoA de tipo selvagem e mutante, bem como para pesquisar mutantes que melhor se liguem aos monômeros de lignina em questão e procurar por razões que conduzem a associação enzima-substrato. Se o tempo permitir, o alargamento do sítio de ligação da enzima será realizado de maneira semelhante: a partir da análise de conservação de resíduos, examinaremos as mutações que podem alargar a fenda de ligação sem grande perda de atividade. Finalmente, esta proposta BEPE está alinhada com o objetivo global de criar uma economia amiga do ambiente. O desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a reinserção de subprodutos de resíduos na linha produtiva, reduzindo a quantidade de resíduos e as taxas de extração, é um meio promissor para o desenvolvimento de uma economia mais sustentável. Este projeto visa ajudar a atingir esse objetivo por meio da ciência de ponta, utilizando simulações computacionais de última geração que possam elucidar mecanismos de valorização da lignina. (AU)

Durante a evolução, somente uma pequena fração do espaço das sequências de proteínas foi amostrado. A área de design de proteínas de novo tem como objetivo explorar o espaço de sequências não visto durante a evolução para customizar proteínas com diversas aplicações em biologia e ciências de materiais. Por muitos anos, a área dependeu de testar experimentalmente uma proteína por vez com uma taxa de sucesso muito baixa. Recentemente, o Dr. Rocklin desenvolveu um ensaio que avalia a estabilidade de proteínas em larga escala e permite testar e classificar milhares de proteínas de acordo com a estabilidade de seu enovelamento. Esse ensaio também permitiu interrogar quais as variáveis associadas à sequência e à estrutura dessas proteínas que determinavam a sua estabilidade através da construção de modelos de aprendizagem de máquina preditivos. Esses modelos significativamente aumentaram a taxa de sucesso para as novas proteínas desenhadas. Entretanto, além de serem estáveis e bem enoveladas, proteínas exibem dinâmica e existem em um conjunto de estados que definem o seu perfil de energia o qual tem impacto direto na suas funções. Esses estados estão normalmente escondidos da maioria dos experimentos e nunca foram estudados em larga escala. Neste projeto, nós propomos o desenvolvimento e a aplicação de uma nova metodologia que se baseia na expressão, purificação e análise paralela de milhares de proteínas por troca de hidrogênio/deutério associada a espectrometria de massas para derivar quantitativamente o perfil de energia de nanocorpos. Essa classe de proteínas é extremamente importante em diversas aplicações na pesquisa, na área de diagnósticos e como biofármacos, mas apresenta baixa taxa de sucesso devido a propriedades biofísicas desfavoráveis tais como propensão a formação de agregados. Aqui, nós objetivamos construir modelos de aprendizado de máquina treinados em um grande conjunto de dados experimentais coletados para alguns milhares de nanocorpos que nos permitirá aprender como engenheirar nanocorpos com perfis energéticos otimizados para diversas aplicações. (AU)

Lignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, holds a promise of environmentally friendly bioenergy production in Brazil. However, enzymatic hydrolysis, currently considered a method of choice in biomass saccharification, is hampered by considerable cell-wall recalcitrance. To make this technology sustainable and cost effective, our comprehension of cellulose enzymatic hydrolysis should be significantly improved. Here we propose to conduct systematic structure-functional studies of Trichoderma cellulases and auxiliary proteins active in cell-wall degradation using a combination of X-ray protein crystallography, biophysical and biochemical studies, molecular dynamics simulations, statistical coupling analysis aligned with the site-directed mutagenesis and enzymatic assays aiming to obtain in-depth comprehension of cellulose hydrolysis. We plan to contribute toward structural analysis of Trichoderma reesei endoglucanases by solving a crystal structure of endoglucanase II (Cel5A), main enzymatically active, but structurally uncharacterized endoglucanase of this important industrial fungus. Moreover, we will contribute toward our knowledge of Trichoderma cellulases molecular organization by solving X-ray structures of main Trichoderma harzianum endo- and exoglucanases (primarily focusing on Cel7A and Cel5A) and by comparing them with the correspondent T. reesei enzymes. We also aim to structurally characterize swollenins, non-hydrolytic proteins, shown to enhance cellulose hydrolysis catalyzed by celulases, and to study thermodynamically its interactions with cellulose. In addition, we will construct chimeric enzymes by fusing of swollenin with the cellulases and will study enzymatic properties of such chimeras. Furthermore, we will conduct systematic molecular dynamics studies of the cellulases and swollenin, and investigate their flexibility by hydrogen deuterium exchange followed by massspectrometry. Finally, we will use all these acquired knowledge to modify the proteins using site-directed mutagenesis aiming to better comprehend molecular basis of their function and to produce enzymes and their mixtures with enhanced hydrolytic properties. (AU)

Os receptores nucleares estão dentre as mais importantes moléculas envolvidas na regulação intracelular, pois participam na transmissão de diferentes sinais internos e externos para a regulação de programas genéticos. A programação genética estabelecida ou modificada por essas proteínas afeta praticamente todos os aspectos da vida de organismos multicelulares. A regulação transcricional e a seletividade promovida pelos receptores nucleares estimulam a intensa pesquisa que vêm sendo realizada na tentativa de decifrar a complexa rede de eventos moleculares que promovem a sua capacidade de regulação da transcrição e descobrir as regras que definem seu controle, no espaço e no tempo, sobre as interações proteína-proteína e proteína-DNA, abrindo possibilidades para o desenvolvimento de drogas mais eficientes com valores terapêuticos superiores. No presente projeto, planeja-se estudar os receptores nucleares por cristalografia de proteínas, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), métodos bioquímicos e biofísicos, bem como por simulações biocomputacionais, para se entender como a ligação de ligantes específicos (agonistas e antagonistas) induz respostas conformacionais na estrutura tridimensional dos receptores e influencia seus estados de oligomerização e as interações com proteínas co-reguladoreas (co-ativadoras e co-repressoras), bem como modifica a sua estabilidade. Planeja-se também estudar o reconhecimento dos elementos responsivos de DNA por receptores nucleares por cristalografia de proteínas, SAXS e anisotropia de fluorescência. Finalmente, planeja-se investigar papel de dinâmica dos receptores nucleares no seu funcionamento, objetivando determinação dos caminhos preferenciais de dissociação dos ligantes dos receptores nucleares através de simulações computacionais pro dinâmica molecular e os estudos experimentais das mudanças da mobilidade dos receptores usando a técnica de troca hidrogênio/deutério em combinação de espectroscopia de massa. É importante ressaltar que estas são metas com impacto imediato na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se inserem dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos com os interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo. (AU)